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必博BBO知识分享 || 蛋白翻译后修饰研究：Middle-down分析方式

发布时间： 9/22/2022 3:21:02 PM

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背景介绍

Bottom-up的分析策略是一种将蛋白质/酶的大片段混合物分解成小片段的肽段以进行分析的策略，被广泛应用于蛋白质组学研究。

Middle-down的分析策略使用不同的酶来获得较长的肽，采用此方法可以分析较长的肽链上同时发生的几种翻译后修饰。

Top-down分析策略不需要进行酶解过程，直接分析完整的蛋白质，这种方法可以获得完整的生物学信息。

下面将简单介绍Middle-down方法在蛋白质/蛋白质组学分析及抗体药物分析方面的应用。

Middle-down是一种新兴的方法，可用于研究蛋白质以及蛋白质组学。Middle-down方法涉及蛋白水解或化学降解步骤（这是Bottom-up方法的特征）获得的短肽（而不是“完整蛋白质”），但所得肽段的大小比Bottom-up方法中得到的肽段大。利用Bottom-up方法通常得到长度约为7-20个氨基酸残基（M：0.8-2kDa），Middle-down将生成长度为约20-100个氨基酸的肽段，分子量（M）：2.5kDa

Middle-down的检测流程，简述如下：

1、蛋白质水解

通过优化蛋白水解的孵育时间或通过适当控制酶和底物的相对浓度，对蛋白质的Middle-down研究进行了限制性消化，使用广泛可用且相对便宜的蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。为了简化此过程，已有一些特殊的酶如OmpT、Sap9和IdeS用于Middle-down的检测。OmpT是一种属于omptin家族的新型蛋白酶，具有催化连续二碱基位点 K↓R、R↓R、R↓K和K↓K之间肽键切割的特异性；Sap9（白色念珠菌) 是一种源自yapsin家族的天冬氨酸蛋白酶；两种酶都能够产生长度>2kDa的肽；IdeS是一种半胱氨酸蛋白酶，一种来自Streptococcus pyogenes的免疫球蛋白降解酶，可特异性切割所有IgG亚类的铰链区，通过IdeS市售抗体西妥昔单抗、利妥昔单抗等进行IdeS处理，获得了三种更大尺寸的蛋白水解肽。

2、分离

与基因组研究相比，蛋白质组学研究相对更复杂，因为蛋白质组学研究涉及蛋白质同种型、翻译后修饰和各种分析的表征，以监测细胞/组织生长不同阶段的表达水平。因此，不同类型的分离策略对于蛋白质组学至关重要，以降低蛋白质组的复杂性。各种分离或色谱方法的应用可以显着影响 MS 对低丰度水平的蛋白质/蛋白水解肽的检测和分析。蛋白质组的分离包括凝胶电泳、毛细管电泳、反相色谱。

3、质谱检测

质谱仪基本上具有三个模块，即离子源或电离源、质量分析器和检测器。由于 ESI和MALDI等软电离方法的出现，这两种电离模式可以成功地应用于各个领域，主要是为了完整的分子量测量。事实上，蛋白质组学领域的快速发展主要是通过应用这两种电离模式来推动的。MALDI主要产生完整肽或蛋白质分子的单质子化离子，而蛋白质或肽的多质子化离子种类通过ESI检测/产生。

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从大肠杆菌到酿酒酵母，从中国仓鼠卵巢（CHO）细胞到转基因动物，多种宿主已被成功用于生物技术药物生产，在用于药物生产前，一般通过基因工程手段改造宿主的遗传信息以适于高效的药物生产，对改造的遗传信息和药物序列分析是产品/工艺开发和质量研究的重要部分。将改造的质粒转染表达细胞（例如CHO），加压筛选出可稳定表达目的基因的细胞株，经过放大培养、纯化获得目的产物。

筛选得到的细胞株在传代过程中可能发生遗传突变，这将导致细胞群的微观异质性，而且突变株还可能获得选择优势而产生克隆替换。在包括疫苗、基因治疗和治疗性蛋白等生物技术药物的生产过程中，这些自发性突变对最终产品的质量构成风险，因此对最终的蛋白产物进行氨基酸序列的分析至关重要。蛋白药物具有很高的异质性，这些药物利用不同的表达系统（例如CHO细胞）产生，同时会伴随多种修饰，例如糖基化、N端焦谷氨酰胺环化、C端赖氨酸加工、脱酰胺、异构化和氧化。

当将蛋白质等生物大分子引入质谱仪时，它们会被离子化并以各种电荷状态进行检测，因此检测灵敏度低于肽。相比之下，使用LC-MS/MS对胰蛋白酶消化获得的肽片段进行定量的自下而上蛋白质组学提供了更高的检测灵敏度和良好的选择性。对于日常的治疗药物监测，可以使用这三种方法中的任何一种来实现。然而，对于临床前PK和TK中的少量血样使用实验动物进行分析，或用于监测人体临床研究中的药物消失，需要LLOQ低于1μg/L的更高灵敏度检测。这种分析通常通过自下而上的方法进行。

由于糖链结构的多样化，色谱图和MS光谱中都会出现多个峰，因此Top-down的蛋白质组学方法不适合高灵敏度的生物分析。已经报道利用Middle-down蛋白质组学方法将治疗性mAb转化为高同质性和低分子量片段并使用高分辨率质谱法对其进行量化。治疗性mAb的IgG用IdeS消化以产生F(ab')2和Fc/2片段，用还原剂处理F(ab')2裂解二硫键并将F(ab')2转化为两条轻链和两条约25kDa的Fd链。使用IdeS的Middle-‍‍down蛋白质组学方法用于评估抗体的复杂性、长期储存稳定性和治疗性mAb制剂的生物相似性。

下表总结了使用Middle-down方法的治疗性抗体的应用。

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Middle-down方法已经广泛用于蛋白质组学及抗体药物的表征分析。Middle-down方法可能是识别和表征蛋白质或蛋白质组的更好选择，它可以弥补Bottom-up和Top-down研究的不足，因此它对于实现各种生物学目标是必不可少的。

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参考文献

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[3] Todoroki K , Mizuno H , Sugiyama E , et al. Bioanalytical methods for therapeutic monoclonal antibodies and antibody–drug conjugates: A review of recent advances and future perspectives - ScienceDirect[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 179.

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